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深圳ag8亚游集团检验检测科技有限公司是运用分子诊断技术开发、销售兽医诊断和公共卫生领域里病原检测产品的生物高科技公司,已通过国家高新技术企业认定,同时提供分子生物学各类实验的技术支持和技术服务。
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PCR实验常见问题
2014-03-27
1/ 何谓PCR?
PCR是多聚酶链式反应(Polymerase ChainReaction) 缩写,是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法,能使极少量的基因组DNA或RNA样品中的特定基因片段,在短短几小时内扩增上百万倍。
2/实时荧光PCR和普通PCR的区别?
普通PCR技术:对反应的终产物进行半定量分析或定性分析。
实时荧光PCR技术:对反应中每一个循环的产物进行定量及定性分析。是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。
1).实时荧光PCR 在PCR体系中加有SYBR Green或者探针,普通的PCR则没有。
2).实时荧光PCR上机后从电脑上直接读出结果,普通的PCR需要通过电泳分离特定条带,紫外线下或用凝胶成像系统观察和分析结果。
3/荧光本底信号和阈值线怎么确定?
荧光本底信号:3-15个循环的荧光信号作为荧光本底信号;
阈值线: 3-15个循环的荧光信号(本底信号)标准差的10倍为阈值,阈值线原则上要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值,同时要尽量选择进入指数期的最初阶段(拐点处),并且保证回归系数大于0.97。
4/什么是Ct值?有什么作用?
Ct值:每个反应管内的荧光信号达到阈值时所经历的循环数。
作用:对于定性实验来说,出现Ct值就表示阳性。Ct值越小表示反应体系初始 DNA 数量越多;Ct值越大表示反应体系初始 DNA 数量越少;根据Ct值的大小可以推断初始 DNA 的数量。
5/实时荧光PCR需几步操作?
1). PCR反应液配制;2). 模板提取; 3). 加样;4). 上机(实时荧光PCR仪器);5). 实验结果分析。
6/实时荧光PCR特点?
1).灵敏度高;2).特异性强;3).PCR实验过程全封闭,无PCR后实验操作;
4).采用dUTP—UNG酶的防污染系统,有效降低污染机率;5).实时反映扩增过程,更适用于定量;
6).定量范围宽,可达到10个数量级,无需稀释样品;
7).可实现一管多检;8).仪器自动分析,更快获得结果。
7/实时荧光PCR的扩增程序?
基本步骤包括高温变性(denaturation);低温退火(annealing);中温延伸(extension)三步反应多次循环。前期还包括UNG酶处理,预变性阶段。
8/实时荧光PCR实验中应注意哪些问题?
防止PCR实验交叉污染,在操作上要戴一次性无粉手套,避免使用有粉乳胶手套,勤换手套;加样时严格按照移液器规范操作,轻吸轻吹,避免形成气溶胶污染环境和人员;PCR反应结束后,不要打开PCR反应管盖,放置在统一的容器密闭销毁。
9/实时荧光PCR操作过程中哪些环节需注意防止污染?
1).合理分隔实验室:将配制PCR反应液、样品的处理、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开。最好能划分①PCR反应液制备区、②标本处理区、③PCR循环扩增区、④PCR产物鉴定区,其实验用品及移液器应专用。人员和物流遵循单向原则。实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA。
2).移液器:移液器污染是一个值得注意的问题。由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入移液器内或粘上移液器头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸样要慢。吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染。
3).预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装。如有可能,PCR反应液应预先配制好,然后小量分装,-20℃保存,以减少重复加样次数,避免污染机会。另外,PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱。
4).防止操作人员污染。使用一次性手套、吸头等耗材。
5).设立阳性对照、阴性对照。阳性对照以能出现扩增值的最低量的标准病原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
6).选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入。打开离心管前应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部。打开管盖动作要轻,以防管内液体溅出。
10/标准曲线的线性关系不佳是什么原因?
稀释和加样存在误差,使得标准品不呈梯度;模板中存在抑制物;试剂出现降解,应避免试剂反复冻融;有的培养基也可能影响到PCR扩增。
11/实验结果的重复性不好可能是什么原因?
1).加样不准确。 2).荧光PCR仪孔间温度条件有差异,即温度均一性不好。
3).样品模板浓度过低。样品初始浓度越低,重复性越差,应减少样品的稀释倍数。
12/试剂盒中阴、阳性对照起什么作用
为确保检测结果的准确性,在进行每次实验时,请务必进行阴阳性对照实验。
1).阴性对照:判定实验有无污染。如果实验没有污染,阴性对照的FAM和/或HEX通道均无信号增长,如果出现信号则实验结果不可靠,应检查实验过程。污染分为两种:
a:单个标本污染,这种情况问题比较好解决,重新进行实验即可。
b:实验室污染,如果所有的样本都出现阳性结果,那很可能发生实验室污染。此时应该严格查找污染源,排除污染。
2).阳性对照:判断试剂盒是否有效。阳性对照的FAM和/或HEX通道应有相应的荧光信号增长,Ct值均应小于或等于25。下面两种情况,则需具体分析:
a:如果Ct值大于25,则试剂盒性能下降,可能在保存或其它环节出现问题;
b:如果无Ct值,则本次实验失败;应检查操作是否出错、试剂盒是否失效。
13/ 阴、阳性对照品和样本加样量是否需要一样?
阴、阳性对照加样量和样本加样量需要一致,这样才有对比意义。
14/如何控制实验过程中可能出现的假阳性问题?
为尽量避免实时荧光PCR结果出现假阳性:
1).避免实验室环境污染。
2).防止荧光干扰,PCR反应管管壁和管盖应避免用手直接接触,并避免使用任何颜料笔在PCR反应管上标记,实验操作过程中戴一次性无粉手套。
3).实验用的耗材避免污染,离心管、吸头等需灭菌处理。
4).严格按照移液器使用规范操作,轻吹轻吸。5).防止标本间交叉污染。
15/ 实时荧光PCR仪的开关机顺序是怎样的?
按照正确的开关机顺序操作,有助于延长仪器的使用寿命,减少仪器出故障的频率。
开机顺序:先开电脑,待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机,等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的软件,进行实验。
关机顺序:确认实验已经结束后,首先关闭信号收集软件,然后关掉定量PCR仪主机的电源,最后关闭电脑。
16/ 怎么样的实验室环境才能保证仪器设备正常运行?
良好的实验室环境有助于延长仪器,特别是荧光定量PCR仪的使用寿命,减少仪器出故障的频率。推荐做到以下几个方面:
电源:推荐配备合适的UPS或稳压器。
通风:仪器的通风应该没有阻挡。
温度:推荐实验室配备空调,温度应该控制在10-30℃之间。
湿度:20-80%;对于潮湿的省份,推荐实验室配备除湿机。
空间:易于操作,安全。
17/实时荧光PCR实验无Ct值出现,可能什么原因?如何解决?
1).循环数不够。一般都要在35个循环以上,可根据实验情况增加循环(如至45cycles),但高于45个循环会增加过多的背景信号;
2).检测荧光信号的步骤有误。一般SYBRGreen采用72℃延伸时采集,分子信标一般在退火结束时或延伸结束时采集信号;
3).引物或探针降解。可通过PAGE电泳检测其完整性;
4).模板量不足。对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起;
5).模板降解。应避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
18/ 实时荧光PCR实验无信号出现,可能什么原因?
1).荧光采集通道设置错误;2).荧光PCR仪光路故障;3).扩增采集模式设置错误;4).样本编辑错误。
19/什么原因会造成同一份样品在不同管中的结果差异较大?
1).反应液在管盖或管壁上:在 PCR 加样完成后,最好用微型离心机将PCR反应管点动离心,使反应液沉至管底。因为反应液在管壁或管盖上时,会严重影响实验结果;
2).加样错误:由于加样数量太大,容易造成加样错误,如漏加某管样本或将两个样本加在一个孔中;
3).加样不准确:由于 PCR 反应的加样量都很小,在加入量少于 2?L 时,误差可以达到20%(可以通过万分之一天平来准确定量)。移液器的质量、吸头的质量、枪头的使用次数等都会影响结果,最好使用进口硅烷化的吸头,不要使用清洗后重复的枪头;
4).盖子没有盖紧或忘记盖盖;5).光盖被污染了:如将编号写在光盖上了。
20/ 如何提高同一批实验结果的均一性?
在实际操作时,先根据所需的反应数,配制反应混合物,混匀后分装,尽可能用同一支移液器,同一个吸头。
21/ 如何防止程序设计错误?
程序设计完成后一定要仔细检查,以免出错造成损失;常用的程序最好调用以前使用过正确的程序文件。
22/水浴和干浴时,如有爆管该如何处理?
在水浴和干浴时如发生爆管,应及时处理,减少污染的发生。做好实验记录。在时间充裕的情况下,应及时处理爆管标本,重新抽提,防止标本间交叉污染。
23/ 配制不同混合液时,需要换枪头吗?
需要。配制同一批次不同混合液时,必须换枪头;配制不同批次同一混合液,也必须换枪头。同时建议还应配制到不同的离心管中,因试剂存在着一定的批间差,每个离心管中的混合液加入酶时,也应更换枪头。
24/阳性对照需在拆封试剂盒后混匀离心?
试剂经过运输等过程中,阳性对照溶解吸附在管壁及管盖上。为防止打开阳性对照时液体溅出,应在打开阳性对照前,首先混匀离心,使其沉至底部;然后再打开离心管盖,避免污染。同时,除阳性对照以外的其它试剂盒组分,在使用开盖前,也需先混匀离心。
25/实时荧光PCR仪器只有F1/F2和530nm/560nm、610nm波长等怎么办?
现在市面上的实时荧光PCR仪器软件中FAM通道是第一通道,F1和530nm波长对应的是FAM染料,HEX对应560nm,F2通道那要根据仪器厂家对实时荧光PCR仪器通道说明,有的仪器F2通道是ROX通道或HEX通道。
26/ 针对不同样品的DNA模板如何处理?
1).粪便、呕吐物标本  腹泻,食物中毒病人粪便、呕吐物标本可以直接处理:
①根据粪便或呕吐物的量,加入0.5-1mL无菌生理盐水悬浮,静置5min;②尽量吸取上清至1.5mL无菌离心管中,12000 r/m离心5min;③去除上清,沉淀中加入核酸提取液50?L,悬浮沉淀后100℃煮5min;④12000 r/m离心2min,取上清。
非腹泻,食物中毒病人粪便、呕吐物标本需增菌后处理:
①粪便,呕吐物标本中加入相应的增菌液进行6-8h或过夜增菌;②取1mL增菌液加到1.5mL无菌离心管中,12000 r/m离心5min后弃上清;③加入800?L无菌水悬浮沉淀,12000 r/m离心5min;④去除上清,沉淀中加入核酸提取液50?L,悬浮沉淀后100℃煮5min;⑤12000 r/m离心2min,取上清。
2).食品标本
①选择不同细菌的相应增菌液进行6-8h或过夜增菌; ②取1mL增菌液加到1.5mL无菌离心管中,12000 r/m离心5min后弃上清;③加入800?L无菌水悬浮沉淀,12000 r/m离心5min;④去除上清,沉淀中加入核酸提取液50?L,悬浮沉淀后100℃煮5min;⑤12000r/m离心2min,取上清。
3).菌落或菌苔
①鉴定可疑菌株时,在1.5mL无菌离心管中加入100?L核酸提取液;②用接种环刮取3-4个菌落到核酸提取液中研磨制成菌悬液;③ 100℃煮5min;④12000 r/m离心2min,取上清。
27/PCR实验室平面布局?
临床基因扩增检验实验室原则上分为四个单独的工作区域:试剂贮存和准备区、标本制备区、PCR扩增区、扩增产物分析区。为避免交叉污染,进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行,即只能从试剂贮存和准备区(包括扩增反应混合物配制)→标本制备区→PCR扩增区→扩增产物分析区。对于荧光定量PCR,由于其密闭分析体系在PCR过程中就进行了产物分析,故可以不设立扩增产物分析区。
各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。
28/ 在做实时荧光PCR实验时要注意些什么呢?
1).在操作中,应使用不含荧光物质的一次性手套(经常替换)、一次性移液器吸头(带滤嘴自卸式);不能用手直接触摸毛细管、离心管底部。在试剂准备和标本处理时应使用生物安全柜(负压式)或防污染罩,以防止对环境的污染。
2).离心机、PCR扩增仪等仪器设备应经常用75%乙醇擦拭消毒;每次实验前后用10%次氯酸或75%乙醇擦拭移液器、操作台。
3).实验中涉及的有害有毒的标本及试剂应该妥善放置,专人保管;废弃物应置专门容器中,妥善处理。
4).荧光探针试剂应避光保存,加入反应液体后,应尽快配置好反应体系进行扩增。
5).配制反应体系时,应注意移液器的使用方法。所有的液体应加样于近液面处;液体的混匀不能使用移液器吹打。反应体系配制完毕后低速离心数秒,避免产生气泡。
6).配制反应体系过程中若需标记,请在试管架或离心机管架上标记,不要直接标记在离心管上。